OncoImmunin公司简介

新技术开发的需求/理由：

后基因组学/蛋白质组学时代对用于在生理相关环境中测量生物活性分子的稳健，具有成本效益和高通量技术的需求不断增长。满足此需求的有效方法是开发工具和策略，以将报告分子传递到活细胞和组织中。这不仅用于引入可以评估真实生理过程的试剂，还为开发有效的疗法提供了新途径。

回应-OncoImmunin，Inc .：

OncoImmunin，Inc.由Akira Komoriya博士和Beverly Packard博士于1994年创立。该公司是马里兰大学技术进步计划的早期参与者，后来毕业于一家拥有先进设施的成熟研发公司。目前，它位于马里兰州盖瑟斯堡，该地区拥有中小型生物技术公司。迄今为止，OncoImmunin已获得了多项具有新应用的美国和专有技术以及正在审查的CIP和PCT。

OncoImmunin-基础技术的成功之处：

首先，设计，合成，验证并申请了具有高细胞渗透性的探针，用于报告来自所有细胞内环境的蛋白酶活性。这些分子的*方面包括：（1）从蛋白酶切割位点的两侧并入氨基酸序列信息（多十个氨基酸残基），从而不仅为生物学识别提供线性特异性，而且还提供三维特异性（2）跨完整细胞膜，可测量活细胞内的蛋白酶活性细胞（3）明智地选择一系列荧光团，以实现多重化；（4）缺乏探针细胞毒性，可以长时间连续观察。这些特性使用于活细胞测定的多参数应用得以开发，适用于高含量和高通量的候选药物筛选，用于定义细胞过程的分子事件，例如细胞凋亡，自噬，炎症，癌症转移和细胞介导的细胞毒性（包括ADCC）。

开发有助于细胞和组织通透性的结构元件，是OncoImmunin专有设计的基础，该专有设计用于治疗性输送基于肽的蛋白酶抑制剂以及其他细胞内靶标。另外，递送部分可以适合于在溶液中表现出优异的药代动力学性质但不能进入活细胞的小分子。 

近，OncoImmunin的专有设计已应用于由DNA，RNA或任何核苷酸类似物组成的寡核苷酸领域。这种新颖的细胞内递送技术的显着方面是：可以在无毒性的情况下将任何序列的寡核苷酸转运到细胞中，而无需病毒载体，脂质，盐，去污剂，纳米颗粒或电刺激。这种方法有望特别适用于基因调控，其中由于递送载体，例如siRNA和反义治疗剂，人们希望对基因表达或细胞活力的影响极小或没有影响。

生产线：

无论是从事基础研究还是开发研究，OncoImmunin产品都在不断扩展，以响应生物医学界的需求。OncoImmunin的许多探针是OncoImmunin科学家与研究团体之间相互作用的直接结果

OncoImmunin PhiPhiLux®-G1D2说明书

PhiPhiLux-G1D2

底物组成和荧光特征：

每个底物分子由荧光团（非荧光素！）均匀标记的肽组成。裂解的底物具有以下激发和发射峰：<unk>_ex=505 nm 和 <unk>_em= 530 nm。（完整的荧光，i.e.、预裂解、荧光蛋白酶底物未*淬灭（见下文）。）蛋白酶识别序列为 DEVDG我在那里₁和 P₁残留物在红色和蓝色分别。

组件：caspase 3底物试剂盒目录号 A304R1G-5 包括 4 个绿色-加盖小瓶，每瓶至少含 940<unk>l底物和 1 瓶 60 mL 流式细胞仪稀释缓冲液。caspase 3底物试剂盒目录号 A304R1G-8 包括 8 个绿色-加盖小瓶，每瓶至少含 770<unk>l底物和 2 瓶 60 mL 流式细胞仪稀释缓冲液。  事件底物每瓶在 RPMI 1640 培养基中的浓度为 10<unk>M  含 25 mM HEPES。整个未开封的试剂盒可在室温或 4⁰C. 如有小瓶  是  打开，然后应在-10 至-20 时恢复⁰C. 恢复和/或重新打开前，应轻轻离心小瓶，以除去任何液体 瓶盖。

可能需要的其他试剂：胎牛血清 (FCS)。

通过流式细胞术分析

培养条件：

从您的方案中删除涉及固定或透化的所有步骤。请勿修复底物-用于抗体或其他试剂标记的暴露细胞。

• 使用选定的凋亡诱导试剂（凋亡素）和/或抑制剂处理靶细胞。每个样本集中应包括两个对照样本，一个有溶剂（有机助溶剂），一个没有溶剂（有机助溶剂）。溶媒浓度不应超过 0.3% (v/v)（以 0.1% 为佳）。（如 E 中所述，FITC 峰值通道以及  应确定含和不含溶剂的半胱天冬酶阴性细胞的可能散射变化，以避免错误结论。）
• 处理后，将细胞等分至 1.5 至 2.0 mL 微量离心管中，离心，然后移除所有培养基以尽量减少后续底物稀释。建议：（一）避免使用高速台式离心机；使用类似于正常处理细胞的离心条件。（二）配备细吸头的温和负压吸引，  例如，建议使用移液器吸头。
• 向各离心细胞沉淀中加入 75<unk>l 10<unk>M底物溶液（如果 10%FCS 适当，则加入 8<unk>l FCS）。每个样品的细胞数量应在 50 万至 100 万之间（见下文 A 和 B）。将细胞悬液与底物通过移液。请勿涡旋试管，因为凋亡细胞可能“脆弱”.
• 在 37 ℃ 下孵育试管⁰C 30-60 min 后进行流式细胞分析。（见下文 C。）保存底物生理 pH 条件下：避免直接暴露于底物光照和 pH.

流式细胞仪样品制备和测定：

• 加入 1 mL 流式细胞仪稀释缓冲液洗涤细胞一次，离心，除去所有培养基和缓冲液。用指尖轻弹试管松开细胞团块，然后将松散团块重悬于 1 mL 新鲜稀释缓冲液中. 请勿涡旋含有细胞的试管，而是使用移液器重悬细胞。凋亡细胞可以是脆弱的。（参见  以下。）所有样本应在 37 次试验结束后 60-90 min 内进行分析^oC 孵育。
• 推荐的流式细胞仪设置：用 488 nm 激光线激发，FITC 通道检测。在*年为对照细胞群（不存在凋亡原（如适用，使用溶剂））的细胞设置峰值通道。然后运行凋亡素处理的细胞群。
• 通过上述程序收集数据后，可以删除 PI 阳性细胞，如果ca. 加入 10<unk>l 5-10<unk>g/ml 碘化丙啶 (PI) 溶液，并在流动中重新运行样品c细胞计数器（PI 的终浓度ca. 200 ng/mL），带有 FITC 的点图vs. PE（见 D）。再分析应为加入 PI 后 5-15 min 内。

有用提示和警告：

• 孵育期间的细胞密度底物每份样品应在 50 至 100 万个细胞之间（尽管可分析较低浓度）。建议将直接从对数期培养物中采集细胞的对照样品纳入试验中，以评估默认细胞凋亡水平。
• 在某些情况下，可以使用底物浓度低于 9mM（加入 FCS 至终浓度 10%v/v 将降低底物浓度至 9mM (视上)). 然而，该试剂盒已被配制成用于流式细胞术，与底物浓度at 10 mM 在大多数条件下获得宜性能。活细胞摄取底物在 20 至 30 min 之间达到接近大值，在 37⁰C 在大多数细胞类型中。然而，作为底物摄取可能随细胞类型和特定条件而变化，应优化孵育时间。

• 活细胞摄取底物在 20 至 30 min 之间达到接近大值，在 37⁰C 在大多数细胞类型中。然而，作为底物摄取可能随细胞类型和特定条件而变化，孵育时间应为 优化
• 建议为了鉴别 PI 阴性凋亡和未诱导的细胞群，应首先在不存在 PI 的情况下进行分析，然后在加入 PI 后进行第二轮数据采集。样本  所有样本的稀释体积应相同。点图之间的比较 (FITC)vs. PE）的这两组样本将能够轻松识别 PI 阴性细胞群，因为在两组点图中，这些细胞保持在 PE 轴上的相同位置。因此，如果将门控放置在 PI 阴性细胞周围，然后将该门控内的细胞绘制在 FL1 直方图中，则该方法将导致对未诱导和凋亡的 PI 阴性细胞进行分析。
• 如果一群荧光强度很低的细胞，i.e出现低于未诱导细胞群的情况，则很可能 (i) 样品过度诱导和/或 (ii) 终溶剂浓度导致毒性。因此，应纳入溶剂对照样本。

为了在直方图中看到亮的凋亡细胞群，细胞必须保持其膜的完整性。请注意：所有 OncoImmunin 的原理底物工作是完整的底物扩散穿过所有膜，i.e., 血浆以及细胞膜，通过被动扩散；一旦底物已被其同源蛋白酶识别和裂解，裂解的片段大部分保留在蛋白酶所在的膜侧。因此，裂解底物片段在 PI 阴性细胞中产生阳性信号，一旦细胞失去其膜完整性（如 PI 阳性所示），裂解的片段可能扩散出细胞。由于完整底物的荧光未被*淬灭，加载底物的未诱导细胞群的荧光高于未暴露于底物的细胞群。因此，如果在过度诱导或暴露于高浓度有机助溶剂的情况下，膜完整的活细胞的通透性屏障丧失，那么完整以及裂解的碎片可能从诱导细胞中丢失。

在某些情况下，分析尚未发生半胱天冬酶活化的早期时间点，通过观察峰值通道数量的减少，观察供试化合物本身是否诱导膜渗透性变化可能是有益的。一般而言，PI 阳性或 TUNEL 检测阳性细胞百分比较高的样本中的细胞将处于晚期凋亡和/或坏死。PhiPhiLux 的使用^®-G₁D₂对于含有低百分比 PI 阳性细胞的样本是宜的。

在大多数情况下，建议降低凋亡素浓度，而不是简单地寻找更早的时间点。  PhiPhiLux 分析的适当时间点^®-G₁D₂-阳性细胞应如此大百分比  存在 PI 阴性细胞：理想情况下，样本应包含两者未诱导和半胱天冬酶⁺/PI^-细胞。  条件  应避免仅观察到单一人群。在荧光显微镜下检查细胞可能有助于确定确切的细胞凋亡诱导 条件。

样品数据：

PhiPhiLux-G1D2   荧光显微镜分析

培养条件：

从您的方案中删除涉及固定或透化的所有步骤。请勿修复底物-用于抗体或其他试剂标记的暴露细胞。

在大多数细胞培养物中，少数细胞默认为死亡；应将其用作阳性对照。在无默认死亡的罕见情况下，推荐使用已确定的凋亡素治疗，例如 1<unk>M Staurosporine，以产生阳性对照。

用于标准（非共聚焦）荧光显微镜

• 用选择的凋亡诱导试剂和/或抑制剂处理靶细胞。每个样本集中应包括两个对照样本，一个有溶剂（有机助溶剂），一个没有溶剂（有机助溶剂）。溶媒浓度不应超过 0.3% (v/v)（以 0.1% 为佳）。（如上所述，对于流式细胞术，应确定含和不含溶剂的半胱天冬酶阴性细胞的可能变化，以避免错误结论。）
• (a) 对于悬浮细胞，向每个离心的细胞沉淀中，加入 75ml of 10 mM 底物溶液（加入 8ml of FCS，如果 10%FCS 合适）。每个样品的细胞数量应在 50 万至 100 万之间（见上文 A 和 B）。用指尖轻弹试管，混合含细胞和底物的混悬液. 请勿涡旋含有细胞的试管，因为凋亡细胞可能  “脆弱”.

(b) 对于贴壁细胞，加入足够的底物溶液，使单层细胞或单个细胞*覆盖。与混悬液相同  细胞，在加入前一定要去除所有培养基底物-含溶液，以尽量减少稀释底物。（对于贴壁细胞，建议培养皿底部附有玻璃盖玻片。（联系 OncoImmunin,Inc.针对  此类细胞培养皿的来源。）

3. 在试管或培养皿中以 37 ℃ 孵育细胞样本^oC 30～60 min。确切的孵育时间为细胞  类型和诱导剂  特定。保存底物生理 pH 条件下：避免直接光照至底物以及暴露于 pH.

4. 用 PhiPhiLux 孵育后即刻®-G₁D₂ 底物 溶液：

• 对于悬浮细胞，用 1 mL 流式细胞计数缓冲液或任何生理缓冲液（如 PBS）稀释，离心，并用 1 mL 新鲜缓冲液替换上清液。根据荧光显微镜的灯功率和检测能力，重复细胞清洗（通常再清洗 1-2 次）。每次洗涤后在荧光显微镜下检查细胞，观察是否  背景荧光足够暗，可区分未处理对照细胞和处理细胞。

(b) 对于贴壁细胞，移除 PhiPhiLux®-G₁D₂ 底物 溶液 和 清洗 温和地 与 缓冲液。 执行 a 相似 编号 of 细胞

悬浮细胞样本推荐的清洗循环。每次循环后，在荧光显微镜下观察背景荧光水平。清洗贴壁细胞时应特别小心，因为与非凋亡细胞相比，凋亡细胞通常更容易从平板上分离。因此，建议保存所有洗涤液，直至可识别阳性细胞。

5. 推荐的显微镜设置为荧光滤光片。

用于共聚焦显微镜

由于共焦仪器中存在针孔及其光学过滤效应，可删除清洗步骤。因此，人们可以  具有底物在整个实验过程中存在或在给定实验过程中的任何时间添加底物。

事件底物适用于此类型实验的浓度应小于贮备液浓度 10mM. 建议一系列的底物稀释范围从 5 到 1mM 执行。

当使用共聚焦显微镜时，必须设置适当的探测器增益和激光功率设置。一般在任何细胞培养中，都有少量的凋亡细胞，i.e. 默认死亡的细胞。后者与健康对照细胞结合使用可作为设置动态范围的限制。一个很好的起点是使用默认死亡细胞的信号作为大值的 90%，健康细胞作为阴性或较低的信号水平。

注意：在多个底物浓度，与胞外域的像素强度相比，健康细胞胞内域的像素信号强度通常较低。这是由于完整细胞的膜通透性屏障。  当给定的半胱天冬酶活性被激活后，同源蛋白酶裂解底物，由于细胞的去猝灭，细胞内像素强度水平将高于细胞外强度底物。如果  细胞质面积仅达到细胞外水平，因此在该时间点不能明确声明该荧光强度增加仅由半胱天冬酶活性引起，因为仅给定细胞的膜渗透性增加可解释该增加。然而，强度增加高于背景相关强度底物只有当荧光团与底物通过靶半胱天冬酶对完整细胞的作用去淬灭底物通过切割底物分成两个片段。

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